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Comprehensive Analysis of Bacterial Retention Validation: Key Experimental Considerations and Regulatory Focus Points

 

在前期“濾”見新知系列課堂中,我們系統梳理了除菌濾器的驗證概念及驗證主計劃,本期將聚焦驗證體系中的核心環節——細菌截留測試。細菌截留是過濾系統驗證的關鍵部分,旨在確保除菌級過濾器在藥品生產過程中的性能,通過此測試,可以有效管理風險并保證合規性。特別是在最終無菌過濾步驟中,細菌截留測試確保過濾器在惡劣條件下仍能有效工作,從而保護產品質量,滿足監管要求。測試流程從初步確認細菌生存性開始,逐步評估細菌截留,并在最不利條件下評估過濾影響。最終,根據測試結果和過程參數,確認過濾器在制造商的工藝條件下能生成無菌濾出液。

 

 

本文主要探討細菌截留實驗的法規要求和實施策略,也會討論實驗前的準備工作,如調整工藝條件和挑戰微生物以確保實驗的有效性。重點介紹細菌截留驗證的關鍵點,涉及濾膜測試、過濾前后考量、接收標準和調查程序。最后,概述法規指南近兩年對細菌截留現場核查的關注焦點,包括微生物存活、膜片選擇、滅菌模擬、壓差和動態時間模擬,以及挑戰水平的法規符合性。本摘要旨在為細菌截留實驗提供深入理解及實踐指導。

 

細菌截留實驗法規及驗證策略

在細菌截留實驗中,驗證策略需模擬實際工藝的最差條件,以證明除菌過濾器能在高濃度下產生無菌液體。實驗包含生存性確認、回收率確認和過濾器截留能力確認。

 

根據GMP指南,實驗前需確認微生物在工藝條件下的生存性,若受影響,可通過調整工藝條件、配方、挑戰時間或更換微生物來解決。

 

細菌截留驗證法規核心要點

通過實驗室模擬工藝最差條件,證明除菌過濾器在107CFU/cm2挑戰下產出無菌液體。驗證包含三大模塊:

 

·生存性確認——確保微生物在藥液中存活

·回收率確認——驗證培養方法可靠性

·截留能力確認——實測過濾器除菌性能

 

為何必須做生存性確認?

“應盡可能將挑戰微生物直接接種在藥品中進行細菌挑戰。但是藥品和/或工藝條件本身可能會影響挑戰微生物的存活力,因此在進行細菌截留實驗之前,需要確認挑戰微生物于工藝條件下在藥品中的存活情況,以確定合理的細菌挑戰方法,也即活度實驗(生存性實驗)”--- 《除菌過濾技術及應用指南》,NMPA, 2018年10月

 

當前液體無菌性的確認普遍采用微生物培養法,若待測液體自身具備抑菌或殺菌特性,其培養結果的有效性將無法確認,可能無法真實反映樣本的無菌狀態。因此,在啟動正式驗證前,必須開展微生物生存性確認,以確證目標微生物在該特定料液中能否存活并進行有效培養。

 

總結:若藥液含抑菌/殺菌成分,將導致培養結果失效。提前確認微生物存活狀態,是驗證有效性的前提。

 

除菌過濾工藝驗證策略決策樹

來源:2023版GMP指南

 

GMP指南決策樹里我們可以看出在細菌截留試驗前必須驗證挑戰微生物在目標產品和工藝條件下的生存性:若微生物可存活,則直接將其接種于產品中進行挑戰試驗;若無法存活,需使用該產品預處理待測過濾器(核心方法),隨后采用經充分驗證的替代溶液實施微生物挑戰。

 

替代方案下進行微生物挑戰實驗有如下幾種建議可參考:

a.調整工藝參數:修改(如降低)溫度以適應微生物生存。

b.調整料液配方:改變pH或去除抑菌/殺菌成分(需評估并確保不影響產品關鍵屬性或過濾器兼容性)。

c.限定挑戰時間段:在微生物可存活的特定時間段內進行加菌挑戰。

d.更換挑戰微生物:選用從制劑中或環境監控分離、更能耐受產品或工藝的微生物。

 

細菌截留實驗設計及方法

了解細菌截留的驗證策略后,我們再來展開實驗設計。細菌截留驗證前需進行生存性和回收率實驗,以確定挑戰微生物在特定接觸時長和溫度條件下的LRV值(對數下降值)。如果LRV值≤1,微生物可存活于藥液中,可采用直接方法進行過濾;若LRV值>1,藥液可能對微生物有抑制或殺菌作用,需采用模擬最差工藝條件的不加菌藥液進行工藝模擬,并通過調整溫度、pH值或沖洗系統以去除抑菌物質后再進行加菌挑戰。

 

細菌截留試驗裝置示意圖

 

 

細菌截留試驗最差條件的考量

細菌截留試驗的研究目的是模擬實際生產過濾工藝中的最差條件,過濾含有一定量挑戰微生物的產品溶液或者產品替代溶液,以確認除菌過濾器的微生物截留能力。--- 《除菌過濾技術及應用指南》,NMPA, 2018年10月

 

在細菌截留實驗設計中,需基于驗證所需的最差條件原則,從四個維度論證關鍵參數:


a.藥液性質:滲透壓(高滲透壓可能導致微生物收縮而提高穿透風險)、表面張力及離子強度等物理化學屬性,需識別對截留效率影響最顯著的條件。
b.工藝參數:操作壓力、流速、時間、溫度波動、液體壓力、過濾方式及PUPSIT(使用前滅菌后完整性)等操作變量,應確認這些工藝的最差參數條件。
c.過濾器特性:選擇低泡點濾膜作為挑戰單元,并確保回收濾膜的微生物可培養性。
d.挑戰微生物:采用缺陷短波假單胞菌(Brevundimonas diminuta)時,需通過標準化培養控制菌體形態及活性,使其穿透風險表征最差工藝條件。

 

細菌截留驗證實施要點總結

 

法規指南對細菌截留現場核查要點

近兩年法規機構對細菌截留現場核查的重點包括微生物生存性、低泡點膜片選擇、滅菌程序的模擬、壓差正確模擬、動態過濾時間模擬以及挑戰水平是否滿足法規要求。這些要點確保驗證結果的真實性和有效性,避免因條件選擇不當導致的法規不接受情況。

 

總結 

細菌截留實驗在除菌過濾驗證中有著關鍵作用,旨在通過模擬最惡劣條件測試除菌過濾器的效能。本文闡述了驗證過程中的三個核心步驟:確認微生物的生存性、回收率的確認,以及驗證過濾器的截留能力。在實驗啟動前需準確評估微生物生存性的必要性,以及一系列策略,包括工藝的調整、配方的修改及選擇合適的微生物,以確保實驗的有效性和準確性。此外,我們還深入討論了實驗設計的考量因素,如濾膜的選擇、液體類型以及壓差控制等關鍵參數,旨在為濾器使用者提供一份全面且實用的細菌截留實驗執行指南

 

此外,艾里奧斯還提供設計和驗證過濾系統的服務,旨在降低風險并滿足行業標準,支持法規申報的數據包可靠性。這一系列服務和測試確保了藥品制造過程中的無菌環境,符合法規和質量標準。

 

參考法規與指南

[1] 《藥品GMP指南》(2023年修訂)無菌制劑-上冊;

[2] PDA Technical Report No.26 ,Revised 2008,Sterilizing Filtration of Liquids;

[3] EU Guidelines to Good Manufacturing Practice,Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products,2022;

[4] 《除菌過濾技術及應用指南》(國家藥品監督管理局2018年第85號)。